| 亚细胞构造的离心分离概论 |
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来自:医疗商务网 时间:2005-4-12 |
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现代生物学研究常常需要提取和纯化细胞及组织中的亚细胞构造（细胞核、质膜、内笪纲、高尔基体、线粒体、溶酶体、微粒体等等）。在经过选择的最合适的生物体匀浆制备后，用离心法提取和纯化亚细胞构造是最常用、也是最有效的实验手段。
（一）匀浆制备：
将生物体组织剪切成2~3毫米小块或小片，以每100毫升加湿重5~10克配置组织液，即可用下列各种匀浆设备制备匀浆。
（i）帖床式匀浆机：
最常用，可调速，磨头可手操作升降的实验室匀浆机。
常用聚四氟乙烯园柱型带球形顶端的磨头。定制的硬质玻璃容器，磨头在玻璃容器中既旋转又上下移动。磨头与容器间隙可根据需要调整在0.05~0.15毫米之间。
制备某些大温度敏感的材料，容器可固定在一个封闭园筒中，园筒通以冷却水，避免匀浆制备过程中这样品温度升高。冷却水可用自来水也可以用低温循环水槽的外循环冷却水。
这种匀浆机最常用于"软"组织（脑、肝等）的匀浆制备，常用将速在1500转/分以下，磨头上下升降5~15次。
（ii）剪切型匀浆机。
转头分为硬度、可产生相对剪切运动的多刀刃刀片，转速较高（10000转/分）下，可调。适用于较"硬"组织（肌肉，心肌，内脏等等）的匀浆制备。
（iii）高压 气体破碎法（主要是N2）：20~100大气压，10~60分钟也可以制备匀浆。
（iv）超声波破碎机：可产生很高的液体剪切力。但对生物大分子（DNA，RNA等）有破坏作用，常用于只研究亚细胞结构的匀浆制备。
（v）大量样品用的制备型工业匀浆泵：综合利用机械剪切与细胞真空炸裂原理制造的高效匀浆（均质）设备用于生产型匀浆制备。
（二）过滤：根据样品的实际情况，在匀浆制备前或会，为了滤去某些不得不 破碎的组织颗粒，可用优质棉布或尼龙布（单层或多层）过滤样品。
（三）亚细胞构造的进一步纯化：
(i)溶剂：为了避免质膜及其他亚细胞器的损伤，保证在离心过程中组织不变性，常用的溶剂有1mM EDTA, 0.1~1mM PMSF, 5~10mM Tris或Hepes等等，具体配置请参阅有关文献。
ii)差分法：经过多次繁复的差分离心分离也可以纯化各种亚细胞器，但常常是事倍功率：很大的离心工作量，得到不太高的纯度。由于离心技术的进展，目前已少用，本文不作介绍。（如果有人感兴趣，可与作者联系）
(iii)密度梯度离心法：（简介，详见参考文献）
① 各种亚细胞构造的沉降系数范围：
细胞核：5×106~8×106
质膜（大片）：105~6×105
质膜（小片）：5×101~5×103
内质纲片断：101~103
溶酶体，线粒体：2×103~8×103
②各种亚细胞器的尺寸及其在典型梯度材料中的浮密度：
名称
尺寸
密度
（μm）
蔗糖中
Ficoll
Percoll
Metrizamid
Nycodenz
核
3~12
>1.3
/
1.09
1.22
1.23
线粒体
0．5~2
1.19
1.14
1.10
1.16
1.17
溶酶体
0．5~0.8
1.21
/
1.06
1.13
1.15
质膜（大片）小颗粒
3~20
1.16~1.18
~1.05
~1.03
1.14~1.26
1.11~1.19
0．05~3
1.13
内质纲
0．05~0.3
1.06~1.23
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③推荐的离心参数
方法名称
差分清沉降在0.25M蔗糖液中
速率—区带密度梯度离心5~20g蔗糖液中5℃
等密度离心(ISOPYCNIC)(同左或其他合适介质中
核
1000g×10分钟
500g×10分钟
4000g×60分钟
线粒体
10000g×20分钟
5000g×10分钟
80000g×100分钟
溶酶体
10000g×20分钟
5000g×10分钟
80000g×100分钟
内质纲
150000g×40分钟
10000g×20分钟
100000g×200分钟
微粒体
100000g×60分钟
10000g×30分钟
10000g×360分钟
质膜大片
10000g×15分钟
~100000g×100分钟
~150000g×600分钟
（小颗粒）
100000g×60分钟
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